江蘇省尖底錐形過(guò)濾器
除菌過(guò)濾的目的是從原料藥液里通過(guò)過(guò)濾去除細(xì)菌。如果產(chǎn)品無(wú)法進(jìn)行zui終滅菌，需要采用0.22mm（更小或相同過(guò)濾效力）的除菌過(guò)濾器進(jìn)行除菌過(guò)濾。新版GMP附錄1“第十三章，非zui終滅菌產(chǎn)品的過(guò)濾”第九十一條規(guī)定，與其他滅菌方法相比，除菌過(guò)濾的風(fēng)險(xiǎn)zui大，因此，宜安裝第二只已滅菌的除菌過(guò)濾器再過(guò)濾一次藥液。圖一為除菌過(guò)濾工藝的工藝流程示意圖，澄清過(guò)濾一般采用深層濾芯，去除料液中的不純物質(zhì)，降低料液濁度和生物負(fù)荷度。無(wú)菌過(guò)濾點(diǎn)采用預(yù)過(guò)濾與除菌過(guò)濾組合的方式確保除菌效率和濾芯過(guò)濾性能的穩(wěn)定性。法規(guī)要求的*個(gè)要點(diǎn)是在采用除菌過(guò)濾方法時(shí)，首先確認(rèn)采用的過(guò)濾器為“除菌級(jí)”，達(dá)到此要求后，除菌過(guò)濾法中的其它無(wú)菌保障措施才有意義。定義過(guò)濾器是否為除菌級(jí)，需要依靠過(guò)濾器的微生物截留能力，并完成相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證和工藝驗(yàn)證。目前業(yè)界缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量孔徑，孔徑的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)預(yù)測(cè)微生物截留和比較不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的過(guò)濾器沒(méi)有實(shí)際的意義，因而，需要用微生物截留能力來(lái)定義除菌級(jí)過(guò)濾器（2010版-無(wú)菌制劑GMP實(shí)施指南）。以此可以看出細(xì)菌截留試驗(yàn)對(duì)于除菌濾芯驗(yàn)證的重要性。
細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
新版GMP實(shí)施指南中提到除菌級(jí)過(guò)濾器驗(yàn)證的兩個(gè)主要因素：一是濾膜的級(jí)別，要求可適用的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)或類(lèi)似的方法以細(xì)菌挑戰(zhàn)的方式進(jìn)行；二是工藝驗(yàn)證，由過(guò)濾器的使用者或指派的實(shí)驗(yàn)設(shè)施（例如，過(guò)濾器的生產(chǎn)者或協(xié)議實(shí)驗(yàn)室），使用有代表性的微生物進(jìn)行挑戰(zhàn)，證明過(guò)濾器在生產(chǎn)條件下，可以*去除每個(gè)產(chǎn)品或產(chǎn)品家族中的微生物。應(yīng)建立針對(duì)每個(gè)產(chǎn)品組的科學(xué)解釋并可能需要在實(shí)施驗(yàn)證前經(jīng)合適的監(jiān)管機(jī)構(gòu)審查。細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)就可以*驗(yàn)證過(guò)濾濾芯的細(xì)菌截留性能，也可以充分反映整個(gè)工藝環(huán)節(jié)對(duì)濾芯過(guò)濾性能的影響。因此，在截留試驗(yàn)前必須做好如下準(zhǔn)備：
過(guò)濾工藝評(píng)估：通過(guò)驗(yàn)證服務(wù)調(diào)查問(wèn)卷，客戶(hù)溝通甚至現(xiàn)場(chǎng)拜訪，需要*了解客戶(hù)工藝流程，包括溶劑性質(zhì)（例如水基的、酸、堿、有機(jī)的）、過(guò)濾時(shí)間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過(guò)濾器設(shè)計(jì)規(guī)范，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)具體的情況，再結(jié)合過(guò)濾器本身的一些特性，模擬縮小化的工藝流程，這些流程需要與實(shí)際工藝流程相符或者更為惡劣，確保細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)*按照或者更高于實(shí)際工藝制定。
細(xì)菌培養(yǎng)和篩選：細(xì)菌截留試驗(yàn)采用缺陷假單胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146），要求通過(guò)光學(xué)顯微鏡或者掃描電鏡觀察，直徑為0.3-0.4微米,長(zhǎng)度為0.6-1.0微米，且呈單分散狀態(tài)，這些重要特性需每次進(jìn)行觀察和篩選，以免對(duì)截留試驗(yàn)造成影響。
江蘇省尖底錐形過(guò)濾器
根據(jù)ASTM838-83對(duì)除菌級(jí)濾芯的定義，用107CFU/cm2的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）進(jìn)行試驗(yàn)，下游濾出液無(wú)菌。細(xì)菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)研究的目的就是通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得文件證據(jù)，證明在模擬工藝條件下，過(guò)濾過(guò)程可以持續(xù)去除懸浮于產(chǎn)品或替代流體中的高水平的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌或相關(guān)微生物污染分離物。
細(xì)菌截留試驗(yàn)進(jìn)行前，需要*行細(xì)菌存活性試驗(yàn)，來(lái)了解客戶(hù)產(chǎn)品在模擬的工藝條件下對(duì)截留菌生長(zhǎng)的影響，試想如果客戶(hù)產(chǎn)品在模擬工藝條件下，會(huì)對(duì)截留菌生長(zhǎng)造成影響，甚至無(wú)法存活，那分析濾膜未發(fā)現(xiàn)截留菌，是產(chǎn)品對(duì)截留菌的影響造成還是測(cè)試濾膜過(guò)濾的緣故都無(wú)從而知，因此細(xì)菌存活性試驗(yàn)是截留試驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，可以為截留試驗(yàn)提供重要的理論依據(jù)，以此來(lái)確定截留試驗(yàn)的過(guò)程，是采用單步還是多步進(jìn)行試驗(yàn)。
細(xì)菌截留試驗(yàn)測(cè)試過(guò)程中使用如圖4所示裝置，一共包括CTL1-4四套截留裝置，CTL1-3即為所要驗(yàn)證濾芯的三個(gè)重復(fù)，CTL-4為整個(gè)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組，其中TF1，2，3分別為不同批號(hào)的測(cè)試濾膜，為過(guò)濾精度為0.22微米或者0.2微米的除菌濾膜，且每個(gè)TF上下游都加裝壓力表，用于監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，測(cè)試濾膜兩端的壓力，TF4為對(duì)照，為過(guò)濾精度為0.45微米的濾膜，AF-1，2，3，4均為分析濾膜。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將產(chǎn)品或者替代液配置成一定濃度的挑戰(zhàn)液，一般要求不低于107CFU/cm2，按照模擬的縮小化工藝條件，采用蠕動(dòng)泵將其按照一定的速度通過(guò)測(cè)試和分析濾膜，在試驗(yàn)過(guò)程中，需要在不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)壓力，流速，溫度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行監(jiān)控并記錄，且在細(xì)菌截留試驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束后，對(duì)微生物進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)確定挑戰(zhàn)菌的濃度。
當(dāng)截留試驗(yàn)結(jié)束后，需要將分析濾膜放于平板上培養(yǎng)，如果上游的測(cè)試濾膜為除菌濾膜，即圖中的TF1，2，3，則下游即分析濾膜上不會(huì)發(fā)現(xiàn)截留菌生長(zhǎng)，如果上游的測(cè)試濾膜為非除菌濾膜即TF-4，則下游即分析濾膜上會(huì)發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)菌生長(zhǎng)。根據(jù)分析濾膜上是否有挑戰(zhàn)菌生長(zhǎng)進(jìn)行判斷，對(duì)于對(duì)照CTL-4，因0.45微米濾膜對(duì)于挑戰(zhàn)菌濃度在104～106CFU/cm2時(shí)，無(wú)法達(dá)到除菌過(guò)濾的效果，所以對(duì)照組下游的分析濾膜，即AF-4必定會(huì)有挑戰(zhàn)菌的生長(zhǎng)，這樣一則可以對(duì)挑戰(zhàn)菌進(jìn)行鑒定，鑒定該挑戰(zhàn)菌的純度及形態(tài)特征，二則可以判斷挑戰(zhàn)液的濃度是否已經(jīng)達(dá)到預(yù)期的濃度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
細(xì)菌截留實(shí)驗(yàn)結(jié)果包括細(xì)菌截留前后膜片完整性測(cè)試值，陰性對(duì)照結(jié)果，產(chǎn)品循環(huán)工藝參數(shù)和分析膜片結(jié)果四個(gè)部分。如表1記錄了實(shí)驗(yàn)?zāi)て暾詼y(cè)試結(jié)果，從中可以對(duì)截留試驗(yàn)前和后，濾膜的完整性數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，是否符合濾芯廠家對(duì)于該類(lèi)濾芯的完整性要求。
表2陰性對(duì)照結(jié)果，需要確認(rèn)在未接種截留菌前整個(gè)截留裝置是否保持無(wú)菌。表三為分析濾膜結(jié)果，也是決定細(xì)菌截留試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵指標(biāo)，分為兩部分，*部分為截留菌的濃度，需按要求菌不低于107CFU/cm2，可以分析達(dá)到了ASTM-838對(duì)除菌級(jí)濾芯截留濃度的要求，另外一部分為分析濾膜的結(jié)果，對(duì)于TCL-1，2，3裝置中AF均未發(fā)現(xiàn)截留菌，說(shuō)明TF可以恒定高效的去除挑戰(zhàn)液中的截留菌，對(duì)于對(duì)照組的TCL-4下游的AF4，則發(fā)現(xiàn)有截留菌生長(zhǎng)，可以利用特定的鑒定試劑盒，對(duì)結(jié)果進(jìn)行鑒定，確認(rèn)下游所發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌有且僅為我們的標(biāo)準(zhǔn)截留菌。
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組平均含菌量在 5×`10^4` CFU/100 ML～5×`10^5` CFU/100 ML。陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)。在3次試驗(yàn)所有流量段水樣中大腸桿菌下降至 0/100 ML 時(shí)，可判為實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中飲水消毒效果合格。若陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組含菌量未達(dá)上述要求,應(yīng)尋找原因,糾正后重做試驗(yàn)。
關(guān)于消毒技術(shù)規(guī)范?生活飲用水消毒效果鑒定中飲水過(guò)濾器除菌試驗(yàn)：
1）試驗(yàn)分組
①試驗(yàn)組。申請(qǐng)消毒產(chǎn)品衛(wèi)生許可證時(shí)，按使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定的zui大流量,測(cè)定其對(duì)大腸桿菌的除菌效果。
②陽(yáng)性對(duì)照組,以未經(jīng)消毒的試驗(yàn)菌污染水樣進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù);
③陰性對(duì)照組,以試驗(yàn)所用同批次未經(jīng)使用的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。
2）操作程序
①配制試驗(yàn)菌污染水樣。
②取 2 份試驗(yàn)菌污染水樣,進(jìn)行大腸桿菌活菌計(jì)數(shù)(陽(yáng)性對(duì)照組)。
③按過(guò)濾器產(chǎn)品規(guī)定的zui大流量,將試驗(yàn)菌污染水樣分段通過(guò)飲水過(guò)濾除菌裝置。按規(guī)定過(guò)濾的水量,用無(wú)菌三角瓶分段采集:初始、1/4、2/4、3/4、4/4 等各段流出的水樣(不需加中和劑)。
④對(duì)過(guò)濾后各段水樣,分別取 100ML、10ML、1ML各 2 份,進(jìn)行大腸桿菌活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
⑤將未接種大腸桿菌的試驗(yàn)用同批培養(yǎng)基平板 2 個(gè),置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(陰性對(duì)照組)。
⑥試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
